流式細胞儀測量的數(shù)據(jù)是相對值，因此需要在使用前對系統(tǒng)進行校準或標定。流式細胞儀的校準有二個目的，即儀器的準直調(diào)整和定量標度。通常使用標準微球作為非生物學標準樣品，雞血紅細胞做為生物學標準樣品。

3 主流流式細胞儀型號及其特性介紹

目前擁有市場較大份額的公司是美國的BD（Becton-Dickinson）公司、Beckman-Coulter公司（原名稱Coulter）和德國的Partec公司。

3．1 BD公司流式細胞儀介紹 BD公司生產(chǎn)的流式細胞儀都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter），即熒光激活細胞分選器。其型號種類比較齊全，如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean。現(xiàn)在市場上供應(yīng)的型號有五種：FACSCount（小型流式細胞儀）、FACS CAlibur（流式細胞儀）、FACSA ria（流式細胞分選儀）、FACSV antage SETM（多色分析和高速分選流式細胞儀）、LSR II（數(shù)字化分析型流式細胞儀）。

FACSCount為精確計數(shù)淋巴細胞CD3，CD4，CD8絕對數(shù)而設(shè)計的。FACSCalibur是全自動多色流式系統(tǒng)，偏重于臨床，其整體設(shè)計幫助臨床醫(yī)生快速實現(xiàn)常規(guī)免疫表型、CD4T細胞計數(shù)、DNA、網(wǎng)織紅細胞、血小板等臨床分析，兼具分選功能。配備有二根激光管，可同時檢測4個熒光參數(shù)。可識別粘聯(lián)細胞。

BD FACSA ria流式細胞分選儀為臺式高速細胞分選儀，獲取速度達70，000細胞/s，分析速度達50，000/s。使用石英杯流動檢測池固定光路校準技術(shù)。使用三種激光，多色分析，分析參數(shù)可達15色。兩管或四管分選，可以使用多種規(guī)格的收集管。液流監(jiān)測系統(tǒng)白動監(jiān)測液流斷點，檢查堵塞，實現(xiàn)了細胞分選的無人操作。配件BDACDU裝置，可以在微孔板或載波片上定量分選細胞。

FACSV antage SETM是在FACSV antage的細胞分選功能基礎(chǔ)上推出的分選增強型流式細胞儀。六色熒光分析系統(tǒng)，點對點分選，配置FACS Diva數(shù)字化系統(tǒng)，提供全面的配套試劑。速度和功能優(yōu)于FACSV antage。 BD LSR II是LSR的數(shù)字化升級版，其性能介于FACSV antage SE和FACS Calibur之間，是專為生命科學研究設(shè)計的臺式機。配備固定校準的紫外激光，四種激光立體空間激發(fā)、十色熒光同時分析、電子系統(tǒng)數(shù)字化、比較易學易用。

3．2 Beckman-Coulter公司流式細胞儀介紹 Beckman- Coulter公司生產(chǎn)的流式細胞儀以Profile（早期，現(xiàn)已停產(chǎn)）和EPICS系列為代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式細胞儀，目前市場上有XL、XL-MCL和ALTRA三種型號，其中ALTRA具有分選功能，適用于免疫學、細胞生理、分子生物學、遺傳學、微生物學、水質(zhì)分析和植物細胞分析。Cytomics FC500系列流式細胞儀體積小，可自動進行5種顏色的分析，適用于免疫學檢測，如人類HIV診斷。特別是FC500MPL的獨特設(shè)計可以在同一系統(tǒng)上使用12×75mm的離心管和24或96孔的平板。特別適合工作量大的實驗室。

這二個公司主要針對醫(yī)學研究和臨床工作進行設(shè)計和生產(chǎn)，其產(chǎn)品可應(yīng)用于生物醫(yī)學基礎(chǔ)研究以及臨床檢

測的許多領(lǐng)域，如遺傳、腫瘤、血液、免疫等諸多研究中紅細胞、T細胞、淋巴細胞亞群測定、檢測早期細胞凋亡、腫瘤細胞免疫測定等。這二個公司的流式細胞儀價格昂貴，我國主要購買、使用的單位基本上都是一些醫(yī)療機構(gòu)。

3．3 Partec公司流式細胞儀介紹 與BD和Becman-Coutler公司的產(chǎn)品相比，德國Partec公司生產(chǎn)的流式細胞儀的共同特點是體積小，造價低，易操作，便于攜帶，適合植物學研究，適合邊遠地區(qū)和發(fā)展中國家。德國Partec公司的產(chǎn)品分為三類：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族（Galaxy為早期產(chǎn)品，已停產(chǎn)）。CCA家族包括細胞計數(shù)分析儀CCA和倍性分析儀PA-I。它是單或雙參數(shù)的臺式小型機，可以進行一些常規(guī)分析，如核DNA測定（檢測倍性或細胞周期）、細胞計數(shù)、細胞凋亡。它的特點是體積小，易操作，價格低，檢測范圍廣，可以檢測多種熒光素（如PI、DAPI、Fluorescein）發(fā)出的熒光。PAS家族包括粒子分析系統(tǒng)PAS、粒子分析系統(tǒng)III（PAS-III）和倍性分析儀PA-II。提供三種激光器的三種組合，可檢測十余種熒光染料。最多可檢測和記錄八個獨立熒光參數(shù)。倍性分析儀PA能夠在2分鐘內(nèi)自動測量植物的倍性水平，檢測異倍體。可以對葉片、幼苗、種子、果皮、根、花等植物材料進行分析。在大多數(shù)植物中，異倍體染色體的檢測分辨率為±1條染色體。PA-I使用HBO-100汞燈，屬于弧光燈，可產(chǎn)生紫外激發(fā)光和藍光。PA-II中增加了488nm氬離子激光器，能夠檢測幾乎所有的熒光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，F(xiàn)ITC，F(xiàn)DA等。汞燈發(fā)光是電流經(jīng)過氣體時，氣體電離產(chǎn)生的。它能提供最佳的激發(fā)波長。

CyFlow（R）SL配備三種激光管，可應(yīng)用于諸如人類健康、微生物學、工業(yè)應(yīng)用、過程控制、生態(tài)學等研究。如HIV掃描中免疫標記細胞計數(shù)、食品處理過程中的微生物計數(shù)、細胞凋亡等。它使用l2 V直流電，特別適合邊遠地區(qū)和發(fā)展中國家。

國際上20世紀80年代開始將流式細胞儀檢測應(yīng)用到植物的研究中（Galbraith，1983），眾多學者都認為流式細胞儀是一種準確、快速的檢測DNA含量的方法（Michaelson，1991）。應(yīng)用范圍主要是利用流式細胞儀研究屬內(nèi)、屬間多種植物的DNA含量（Baird，1994；Jacob，1996；HALL，2000）和倍性水平（Costich，1993；Meng，2002）、檢測體細胞雜種（Pfosser，1995；Keller，1996）和游離小孢子培養(yǎng)再生株（Kim，2003）的DNA含量。過去我國應(yīng)用這一檢測技術(shù)的植物研究工作者寥寥無幾，且大多是在國外實驗室完成的。研究內(nèi)容包括植物生理、程序性死亡、倍性鑒定等。植物研究中使用的流式細胞儀基本上都是Partec公司的產(chǎn)品，也有少量是BD公司生產(chǎn)的流式細胞儀。BD公司的產(chǎn)品主要定位于醫(yī)學研究與應(yīng)用，與Partec產(chǎn)品相比，不太適合從事植物染色體倍性的鑒定。主要體現(xiàn)在不能提供植物樣品制備技術(shù)/試劑，數(shù)據(jù)獲取軟件可同時檢測到的倍性數(shù)目少。鑒于目前我國科研院所中使用較多的是BD公司生產(chǎn)的流式細胞儀，在下一篇中將會對利用BD流式細胞儀進行植物倍性檢測的技術(shù)和技巧做詳細報告。

如何選擇流式細胞儀

自七十年代出現(xiàn)第一代流式細胞儀以來，隨著計算機技術(shù)、電子制造技術(shù)、激光技術(shù)及熒光素合成技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代流式細胞儀已今非昔比，制造工藝、功能、精確度有了質(zhì)的飛躍。

流式細胞儀生產(chǎn)廠商推出各種不同型號的流式細胞儀來滿足用戶的不同需要。現(xiàn)生產(chǎn)流式細胞的廠商全球至少有六家，各廠商產(chǎn)品又有不同的系列，各具特點。如何從眾多的型號中挑選出最適合自己的機型，我們還需從分析應(yīng)用出發(fā)，評估自己的需求來決定什么樣的流式細胞儀最具性價比、最適合自己。 ⑴、DNA倍體分析

DNA分析是流式細胞儀最初且是現(xiàn)在應(yīng)用最廣檢測項目。由于惡性細胞DNA含量通常與正常細胞不同，存在異倍體細胞，所以現(xiàn)有很研究評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預(yù)后的關(guān)系。DNA含量檢測還可提供細胞周期方面的信息，這在細胞生物學中運用很廣泛。特別地，它可表示出細胞毒性藥物對細胞作用過程。這些DNA檢測還可與細胞表面標志物標記同時進行，這樣在細胞混合培養(yǎng)中，可通常追蹤表達特異標志物的細胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學反應(yīng)并發(fā)射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。

流式細胞儀要求：488nm光源，575nm濾光片。

⑵、細胞生存能力實驗

使用Heochest 33342染料與DNA特異性結(jié)合，后因細胞活力不同，染料的結(jié)合程度也各異，故可評估細胞的活性度。

流式細胞儀要求：360nm光源，455nm濾光片。

⑶、計數(shù)外周血中檢測網(wǎng)織紅細胞

使用TO染料能夠特異性地與RNA結(jié)合，結(jié)合系數(shù)高達3000，故具有很好的性價比。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm濾光片，液量絕對計數(shù)系統(tǒng)。

⑷、外周血、骨髓采集物中CD34陽性干細胞計數(shù)，臨床上用于骨髓移植前干細胞數(shù)理的測定

使用標準ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE標記CD34抗體，PE-CY5標記CD45抗體。 流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量絕對計數(shù)系統(tǒng)。

⑸、交叉淋巴細胞、粒細胞毒實驗

檢測識別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細胞之間是否存在反應(yīng)有著重要臨床意義，因為這種反應(yīng)會導(dǎo)致移植后發(fā)熱、移植后肺損傷及免疫性粒細胞缺乏癥。流式細胞儀可檢測全血樣本與血清孵育后粒細胞上結(jié)

合的人免疫球蛋白。FITC標記人免疫球蛋白抗體、PE標記粒細胞表面標志物、PE-CY5標記HLA抗體。 流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。

⑹、血小板自身抗體檢測

血小板自身抗體識別人血小板抗原，會引起各種臨床相關(guān)癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細胞可快速準確地檢測血小板自身抗體。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別血小板抗體。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片。

⑺、移植交叉配型

原細胞毒實驗，主要用于避免移植物超急性排拆反應(yīng)。流式細胞儀用于監(jiān)測T或B細胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預(yù)實驗。流式細胞儀因其高精確性已成為該領(lǐng)域內(nèi)的金標準。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別T細胞CD3或B細胞CD29抗體。

儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片。

⑻、檢測細胞經(jīng)抗原或細胞有絲分裂刺激后活化效應(yīng)

淋巴細胞早期活化指標CD69可用來檢測免疫治療效果。流式細胞使用三色分析可監(jiān)測淋巴細胞各亞群活化情況：FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD8抗體、PE-CY5標記的CD69抗體。

流式細胞儀要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm濾光片。

⑼、檢測細胞內(nèi)因子（TH1/TH2細胞檢測）

未活化的淋巴細胞所分泌的細胞因子極少，用流式細胞儀很難檢測出來，因此在檢測前需刺激活化。活化所用的刺激素為PMA 佛波酯+Ionomycin。淋巴細胞在刺激素的作用下，活化分泌細胞因子到細胞外。因流式細胞儀只能對細胞表面或內(nèi)部的抗原進行檢測，如細胞因子分泌到細胞外則檢測不到，因此必須阻止細胞因子的分泌。抑制細胞因子分泌的試劑為Brefedlin A或Monensin。Th1/Th2細胞首先是CD4+T細胞，因此存在著用CD4來設(shè)定細胞群的問題。我們知道CD4不但在T 細胞上表達，還在所有的單核細胞上表達，因此單獨用CD4設(shè)門無法將CD4+T細胞區(qū)分開來。那么我們用CD3和CD4雙參數(shù)設(shè)門是否可以呢？回答是否定的。因為在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表達會迅速下調(diào)，甚至完全喪失，所以不適合于設(shè)門。用CD3和CD8設(shè)門，因CD8不受佛波脂的影響且絕大多數(shù)CD3+CD8-的細胞都是CD3+CD4+細胞，因此可用CD3+CD8-細胞群來確定CD4+T細胞群。FITC標記CD8，PE標記IL-4和，PE-CY5標記IFN-r，APC或PE-CY7標記CD3。

流式細胞儀要求：488nm或633nm（僅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm濾光片。 ⑽、細胞增殖狀態(tài)檢測

核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細胞增殖分裂狀況，在評估腫瘤預(yù)后有重要意義。