基因編輯技術(shù)是一種能夠?qū)ι矬w的基因組及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定點(diǎn)修飾或者修改的技術(shù)。CRISPR/Cas這項(xiàng)明星技術(shù)自問世以來，已經(jīng)吸引了無數(shù)歡呼和掌聲。CRISPR/Cas系統(tǒng)為細(xì)菌與古細(xì)菌中抵御外源病毒和質(zhì)粒DNA入侵的獲得性免疫機(jī)制系統(tǒng)。作為一種新型的基因組編輯技術(shù)，具有設(shè)計(jì)簡單、特異性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)可以分為兩類：第一類系統(tǒng)的核酸酶由多個(gè)亞基組成；第二類系統(tǒng)特別受關(guān)注，其核酸酶由單一的蛋白組成，包括基于Cas9、Cas12和Cas13效應(yīng)蛋白的II、V和VI型。其中最熟悉的 Cas9 蛋白廣泛用于基因組編輯等工作，但是CRISPR-Cas9系統(tǒng)也有它的不足之處，即脫靶效應(yīng)。

CRISPR 蛋白家族中的 Cas13 可以靶向RNA 進(jìn)行基因編輯，其專注靶向RNA的功能補(bǔ)充了靶向DNA的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) Cas13a（ 也被稱為 C2c2）、Cas13b、Cas13c 和 Cas13d 這 4 種蛋白都具有該功能。上述蛋白由于具有 RNA 結(jié)合特性，從而被發(fā)展成為核糖核酸的檢測(cè)器。

在中國科學(xué)院等最新發(fā)布的《2019研究前沿》報(bào)告上，“Cas13”入選生物科學(xué)領(lǐng)域TOP 10熱點(diǎn)前沿。

Cas13發(fā)現(xiàn)及發(fā)展過程

2016年6月：張峰團(tuán)隊(duì)發(fā)明靶向RNA的全新CRISPR系統(tǒng)

張鋒博士是近幾年大熱的CRISPR/Cas9技術(shù)的先驅(qū)開創(chuàng)者之一。在改良及進(jìn)一步操控CRISPR/Cas9這一工具加速基因組研究的同時(shí)，張鋒課題組也在尋求進(jìn)一步擴(kuò)大基因組編輯的工具箱。

2016年6月2日，美國麻省理工學(xué)院和麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)博德研究所的張鋒等在《Science》發(fā)文，揭示 C2c2 是第一個(gè)只靶向RNA而不是DNA的新型CRISPR系統(tǒng)。論文標(biāo)題為“C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[1]”。

C2c2作用機(jī)理

C2c2專注靶向RNA的功能補(bǔ)充了靶向DNA的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。如果說DNA是建構(gòu)細(xì)胞形態(tài)和功能的“藍(lán)圖”，那么RNA就是將“藍(lán)圖”變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)的“工程師”。因此，通過C2c2系統(tǒng)高通量地對(duì)RNA進(jìn)行調(diào)控和改造，可實(shí)現(xiàn)對(duì)于基因功能在更廣泛層面上的調(diào)節(jié)。這對(duì)于疾病的研究和防治均具有深遠(yuǎn)的意義。

該發(fā)現(xiàn)入選《Science》刊登的 20 項(xiàng) 2016 年最有意義的科研發(fā)現(xiàn)。

2016年9月：Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)擴(kuò)大了C2c2的用途

隨后，2016年 9 月，Jennifer Doudna 團(tuán)隊(duì)又?jǐn)U大了C2c2蛋白的用途，發(fā)現(xiàn) C2c2 有兩種不同的 RNA 切割活性，而不是像先前研究中描述的只有1種。這兩種不同的RNA切割活性有各自的功能：第一種是負(fù)責(zé)生產(chǎn)導(dǎo)向RNAs，使C2c2能夠找到特定靶向的RNA分子；第二種是充當(dāng)普通的RNA“剪刀”，用來破壞RNAs。

Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)的研究以“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”[2]為題發(fā)表在9月26日的Nature雜志上。

2017年：王艷麗研究組等對(duì) Cas13a 蛋白及其復(fù)合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析及機(jī)制分析

2017年，中國科學(xué)院生物物理所王艷麗研究組等對(duì) Cas13a 蛋白及其復(fù)合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析及機(jī)制分析。王艷麗的研究組在2016年就開始利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法研究Cas13a的結(jié)構(gòu)和機(jī)理，并在2017年先后發(fā)表了兩篇《Cell 》文章，闡明了不同來源的Cas13a結(jié)構(gòu)。

2017年1月12日，Cell 雜志發(fā)表了王艷麗課題組關(guān)于Ⅵ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白C2c2的結(jié)構(gòu)研究。標(biāo)題為“Two Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNase Activities”[3]。

LshC2c2-crRNA的二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)

該研究解析了Leptotrichia shahii（Lsh）細(xì)菌中C2c2與crRNA （CRISPR-RNA） 的二元復(fù)合物以及C2c2在自由狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了LshC2c2通過兩個(gè)獨(dú)立的活性結(jié)構(gòu)域來發(fā)揮其兩種不同的RNA酶切活性，這為研究C2c2發(fā)揮RNA酶活性的分子機(jī)制提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。

2017年7月27日，Cell雜志在線發(fā)表了王艷麗組和章新政組在VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Cas13a（亦稱C2c2）結(jié)構(gòu)研究中取得的新進(jìn)展。標(biāo)題為“The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a. Cell[4]”。

LbuCas13a-crRNA-target RNA三元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)

該研究成功解析了Leptotrichia buccalis （Lbu）細(xì)菌中Cas13a與crRNA （CRISPR-RNA）及其target RNA三元復(fù)合物3.08?的晶體結(jié)構(gòu)、Cas13a與crRNA二元復(fù)合物3.2?的電鏡結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果證實(shí)target RNA的結(jié)合導(dǎo)致LbuCas13a的兩個(gè)HEPN（發(fā)揮RNA干擾功能的結(jié)構(gòu)域）結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，從而激發(fā)LbuCas13a非特異性地切割任意單鏈RNA的酶切活性。該成果為研究Cas13a發(fā)揮RNA酶活性的分子機(jī)制提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。

2017年2月：張峰團(tuán)隊(duì)又發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新型的 RNA 靶向 CRISPR系統(tǒng)Cas13b 和 Cas13c

2017年2月16日，Molecular Cell雜志上刊登了張峰研究組的新成果。張鋒的研究小組利用一種數(shù)據(jù)挖掘方法，又發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新型的 RNA 靶向 CRISPR系統(tǒng) Cas13b 和 Cas13c。論文標(biāo)題為“Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28[5]”

兩個(gè)新型的 RNA 靶向 CRISPR系統(tǒng)

研究發(fā)現(xiàn)，Cas13b具有靶向和編輯RNA的能力。僅靶向RNA的這一能力使得研究人員能夠以高通量地方式特異性地操縱RNA，從而用于研究廣泛的生物過程。

像Cas13a一樣，Cas13b僅需要單個(gè)向?qū)NA就能找到靶標(biāo)，并且從遺傳學(xué)的角度是可編碼的。此外，Cas13b能夠同時(shí)靶向多個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本。但Cas13b也有一些獨(dú)特的特點(diǎn)，表明它與Cas13a是不同的。這些特性使得Cas13b更適用于微調(diào)基因功能。

2017年4月：張峰等開發(fā)基于CRISPR/Cas13a的診斷平臺(tái)

CRISPR除了“基因魔剪”身份外，還是一種高效、簡便、低廉的分子診斷工具。2017 年 4 月，張鋒團(tuán)隊(duì)和 Jim Collins 團(tuán)隊(duì)等基于靶向 RNA 的 CRISPR-Cas13a/C2c2，開發(fā)的一種高度靈敏的檢測(cè)器 ---“SHERLOCK”，可對(duì)特定病原體的核酸進(jìn)行檢測(cè)。

相關(guān)研究結(jié)果于2017年4月13日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[6]”。

想用CRISPR 技術(shù)來治療人類的疾病，光靠 DNA 編輯是不夠的。因?yàn)椴簧偌膊〉母丛谟?RNA。SHERLOCK的應(yīng)用場(chǎng)景很廣泛。它非但可以檢測(cè)病毒感染和細(xì)菌感染，還可以“偵查”到耐藥基因、癌細(xì)胞的突變。目前該系統(tǒng)已成功用于寨卡病毒和登革熱病毒不同菌株的檢測(cè)。

2018年2月：一日兩篇《Science》展示Jennifer Doudna和張峰基于 CRISPR 系統(tǒng)開發(fā)的全新診斷工具

2018年2月15日，《科學(xué)》雜志在線發(fā)表兩篇重磅文章，一篇為麻省理工著名學(xué)者張鋒實(shí)驗(yàn)室的關(guān)于升級(jí)版基因突變檢測(cè)技術(shù)“Sherlock V2”；另一篇為競(jìng)爭如果對(duì)手加州大學(xué)伯克利分校的杜德拉教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)的基于Cas12a（又叫Cpf1）的新的基因突變檢測(cè)技術(shù)。

張鋒團(tuán)隊(duì)：Sherlock v2 靈敏度提高100倍，可檢測(cè)多種病毒

SHERLOCK 試紙檢測(cè)結(jié)果展示

V2版結(jié)合了其他的Cas酶，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)4種不同類型的病毒或者突變，而且信號(hào)靈敏度也大大提高。論文標(biāo)題“Multiplexed and portable nucleic aciddetection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.[7]”

Doudna 團(tuán)隊(duì)：100%準(zhǔn)確檢測(cè)出 HPV 16 感染

DETECTR 工作原理

Doudna 團(tuán)隊(duì)使用的是 CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)。他們發(fā)現(xiàn)一個(gè)很有趣的現(xiàn)象：這種 CRISPR 系統(tǒng)在剪切靶向的雙鏈 DNA 的同時(shí)，Cas12 的 DNA 酶活性會(huì)被激活，而該酶能非特異性切割單鏈 DNA（ssDNA）。論文標(biāo)題：“CRISPR-Cas12a target binding unleashesindiscriminate single-stranded DNase activity.[8]”

2018年3月：Konermann等發(fā)現(xiàn)CRISPR新工具Cas13d

2018年3月15日，美國Salk研究所的Konermann等人在《Cell》在線發(fā)表一篇基因編輯重磅文章，分離出一種CRISPR-Cas蛋白新成員，屬于Type VI-D型，叫做Cas13d，其能夠有效地精準(zhǔn)靶向降解RNA，在很多方面顯示出比Cas13a更加強(qiáng)大的功能。論文標(biāo)題“Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors[9]”。

該研究的示意圖

Cas13d是一種來自腸道細(xì)菌（黃化瘤胃球菌XPD3002）的CRISPR/Cas系統(tǒng)，被命名為CasRx。同Cas13類似，CasRx能夠特異性的靶向并切割RNA，但比其他Cas13分子量小20%。同時(shí)CasRx介導(dǎo)的敲低效果相對(duì)于其他RNA調(diào)控方法具有更高的效率和特異性。

2018年9月：首次解析出CRISPR-Cas13d的三維結(jié)構(gòu)

2018年9月20日的Cell期刊上，美國沙克生物研究所的研究人員首次解析出CRISPR-Cas13d的詳細(xì)分子結(jié)構(gòu)。論文標(biāo)題為“Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d”[10]。

CRISPR-Cas13d的三維結(jié)構(gòu)

研究人員通過讓CRISPR-Cas13d在不同的動(dòng)態(tài)狀態(tài)下凍存，并利用cryo-EM解析出這種酶的新的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，從而能夠破解它的一系列活性，而不是僅在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察到一種活性。

2019年10月：張鋒團(tuán)隊(duì)再造三合一組合抗病毒的新型CRISPR Cas13系統(tǒng)

2019年10月10日，Molecular Cell 雜志發(fā)表了張鋒研究組新進(jìn)展。研究人員將Cas13的抗病毒活性及其診斷能力結(jié)合在一起，構(gòu)建出一種未來有望用于診斷和治療病毒感染的系統(tǒng)。他們的系統(tǒng)稱為CARVER（Cas13輔助的病毒表達(dá)和讀出限制）。論文標(biāo)題為“Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13[11]”。

CARVER平臺(tái)能將Cas13介導(dǎo)的病毒RNA裂解與基于Cas13的快速診斷讀數(shù)結(jié)合起來，使用特定的高靈敏度酶報(bào)告分子解鎖（SHERLOCK）平臺(tái)，檢測(cè)消滅基于RNA的病毒。

實(shí)驗(yàn)流程

這項(xiàng)新的研究是首批利用Cas13或任何CRISPR系統(tǒng)作為體外培養(yǎng)的人細(xì)胞中的一種抗病毒劑的研究之一。

2019年11月：陳玲玲組使用CRISPR-Cas13系統(tǒng)應(yīng)用于RNA活細(xì)胞標(biāo)記

2019年11月19日，中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）陳玲玲研究組在Molecular Cell雜志上在線發(fā)表了關(guān)于CRISPR-Cas13應(yīng)用于RNA活細(xì)胞標(biāo)記的最新研究進(jìn)展。論文標(biāo)題為：“Dynamic imaging of RNA in living cells by CRISPR-Cas13 systems[12]”。

CRISRP-dCas13 在活細(xì)胞RNA標(biāo)記上的應(yīng)用

該研究對(duì)多種CRISPR-Cas13蛋白進(jìn)行酶活突變后，篩選出了具有較好RNA標(biāo)記能力的dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，并且使用優(yōu)化后的CRISPR-Cas13系統(tǒng)可以對(duì)胞漿和胞核的非編碼RNA和mRNA進(jìn)行有效標(biāo)記。進(jìn)一步聯(lián)合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞內(nèi)不同RNA的雙色標(biāo)記，與CRISPR-Cas9聯(lián)用實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)錄RNA和基因位點(diǎn)同時(shí)標(biāo)記。

Cas13核心研究團(tuán)隊(duì)及機(jī)構(gòu)

據(jù)中國科學(xué)院等最新發(fā)布的《2019研究前沿》報(bào)告顯示，Cas13研究前沿中施引論文的 Top 產(chǎn)出國家前三分別是美國、中國和德國。Top機(jī)構(gòu)包括：哈佛大學(xué)、美國國家衛(wèi)生研究院、中科院、麻省理工學(xué)院等。

Cas13研究前沿中施引論文的 Top 產(chǎn)出國家和機(jī)構(gòu)

在 CRISPR 的研究上，有兩個(gè)先鋒人物是不得不提，那就是麻省理工學(xué)院教授張鋒和加州大學(xué)伯克利分校教授Jennifer A. Doudna。

▲Jennifer A. Doudna（左）和張鋒（右）

張峰團(tuán)隊(duì)

張鋒博士是近幾年大熱的CRISPR/Cas9技術(shù)的先驅(qū)開創(chuàng)者之一。張鋒，2004年畢業(yè)于哈佛大學(xué)化學(xué)物理專業(yè)；2009年取得斯坦福大學(xué)化學(xué)與生物工程博士；2011年加入美國麻省理工學(xué)院（MIT）。

2013年，這位80后的年輕華人科學(xué)家開發(fā)出了可用來編輯DNA、敲除指定基因的CRISPR/Cas系統(tǒng)，自此之后一直致力于推動(dòng)這一技術(shù)走向完美。

2017年1月成為麻省理工學(xué)院理學(xué)院（School of Science）的終身教授，成為麻省理工史上最年輕華人終身教授。

2019年3月，Collins、張鋒等成立了Sherlock Biosciences公司，專注開發(fā)新型診斷/檢測(cè)技術(shù)，用于多種不同的領(lǐng)域。4月，新銳公司Sherlock Biosciences宣布獲得額外投資，A輪融資金額提高到了4900萬美元。

Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)

加州大學(xué)伯克利分校的生物化學(xué)家Jennifer A. Doudna教授是基因組編輯技術(shù)變革的先驅(qū)之一，其帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)取得了諸多令人側(cè)目的CRISPR研究成果。

據(jù)Doudna實(shí)驗(yàn)室官網(wǎng)顯示，僅2016年，研究小組就在Cell、Nature、Science、Nature Biotechnology 、Nature Methods等雜志上發(fā)表論文近三十篇。

參考論文：

1.Abudayyeh, O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. Online First: June 2, 2014.

2.Nature：Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection

3.Two distant catalytic sites are responsible for C2c2 RNase activities Cell， 168（1）， 121-134.

4.Liang Liu, Xueyan Li, Jun Ma et al. The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a. Cell, Published Online: July 27, 2017, doi:10.1016/j.cell.2017.06.050

5.Aaron A. Smargon， David B.T. Cox， Neena K. Pyzocha， et al.Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28.Molecular Cell.January 5， 2017.

6.Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2

7.Multiplexed and portable nucleic aciddetection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.

8.CRISPR-Cas12a target binding unleashesindiscriminate single-stranded DNase activity.

9.Konermannet al.,Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors, Cell （2018），https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.02.033

10.Cheng Zhang, Silvana Konermann, Nicholas J. Brideau et al. Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d. Cell, 20 Sep 2018, 175（1）：212-223, doi:10.1016/j.cell.2018.09.001.

11.Catherine A.Freije et al. Programmable inhibition and detection of RNA viruses using Cas13. Molecular Cell, Published Online: 10 October 2019, doi:10.1016/j.molcel.2019.09.013.

12.Yang LZ, Wang Y, Li SQ, Yao RW, Luan PF, Wu H, Gordon G. Carmichael, Chen LL. Dynamic Imaging of RNA in Living Cells by CRISPR-Cas13 Systems. Mol Cell .2019 Nov 19. pii: S1097-2765（19）30802-0. doi: 10.1016/j.molcel.2019.10.024.

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