KAPA hgDNA定量&QC試劑盒，包含人類基因組DNA樣品NGS文庫構建前，所有基于qPCR定量及質量評估的試劑。

KAPA hgDNA定量&QC試劑盒，是基于SYBR Green I染料法優化的高質量qPCR檢測試劑盒，包含KAPA SYBR? FAST qPCR Master Mix預先稀釋的一系列DNA標準品，以及針對于人類基因組單拷貝的高度保守區域的不同位點所設計的引物預混液。最小片段所對應的引物，用于獲得絕對定量的結果，而額外的引物，用于獲得在DNA樣本中可擴增模板量(質量高的DNA片段)的信息。這個試劑盒由此所產生的質量分數(即Q-ratios)，可以用于預測文庫的產量，或者對于如FFPE DNA這類樣本質量變化很大的樣本的工作流程進行調整。

在單次檢測中，同時評估樣本量以及樣本質量

可以將質量分數(Q-ratios)與測序相關指標相關聯

高性能的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix

預先稀釋好的DNA標準品以及可以直接使用的引物

多功能、易于自動化的工作流程

指示樣品是否有足夠的量以及質量來成功構建文庫

未通過質控的樣本，不再進行后續文庫構建以及測序步驟，從而節約時間和精力

通過檢測進行測序的樣本 (Sequenced Sample) 和Q值不夠、未進行測序的樣本(QNS，Not Sufficient) 各自的Q-ratios。

數據來源于Dartmouth-Hitchcock醫療中心(DHMC)的轉化醫學實驗室。在DNA抽提后以及文庫構建之前，使用KAPA hgDNA定量&QC 試劑盒，可以幫助使用者建立一個額外的質量控制流程，用于在早期的過程中預測測序的質量。DHMC在其擴增子測序工作流程中，根據經驗，使用Q129/41 bp>0.5和Q305/41 bp > 0.2作為判斷標準。

Q-ratios可以幫助判斷NGS文庫構建工作流程中的瓶頸

對于FFPE樣本，文庫質量和測序中質量的主要限制因素是：起始DNA轉化成連接有接頭的文庫分子的轉化率不高

文庫的轉化率，為在Illumina測序平臺上進行靶向重測序而制備

分別從樣本質量參差的80-100 ng FFPE DNA樣本(橙色)和商用人類基因組DNA(灰色)，使用KAPA LTP文庫構建試劑盒來構建測序文庫。FFPE DNA樣本在用Covaris打斷之前，用KAPA hgDNA定量&QC試劑盒進行檢測，然后按照Q-ratios(DNA質量)沿X軸升序排列。Q-ratios如圖中標注。片段化的DNA(平均大小在180 bp左右)在建庫之前，用Qubit? HS dsDNA (Life Technologies) 進行定量；在連接接頭、形成文庫分子之后，使用基于qPCR的KAPA文庫定量試劑盒進行定量。結果顯示，FFPE樣本的文庫轉化率(Conversion Rate，起始DNA分子轉化成連接有接頭的文庫分子的百分比，%)明顯低于高質量的DNA樣本，使得FFPE樣本的文庫分子多樣性受到限制，并且需要在文庫擴增步驟中采取更多的循環數才能得到足夠多的文庫分子進行靶標捕獲，從而使FFPE樣本的文庫的重復率(duplication rate) 更高，靶標覆蓋率(target coverage)更低。

Q129/41 比值和測序中的關鍵指標（如重復率）具有相關性

從250 ng Covaris打斷的FFPE DNA樣本(n=14)和對照組DNA(分別從培養細胞、新鮮冰凍樣本和血液中提取，n=6)，進行手動文庫構建。樣本按照Q129/41-比例升序在x軸上從左至右排列(FFPE樣本用黃色表示，對照組DNA用橙色表示)。文庫構建采用的是NEBNext? 試劑(New England Biolabs)，其中靶標捕獲前和靶標捕獲后的擴增環節(10個循環)采取KAPA HiFi 試劑盒。靶標捕獲使用的是定制的SeqCap EZ panel (300 genes,0.9 MB)。 在Illumina HiSeq平臺上進行了測序(2 x 100 bp)。FFPE樣本的平均靶標覆蓋率(藍色點)是對照組的四倍(1,247X, vs. 301X)，平均重復率(紅色點)是對照組的兩倍(75% vs. 38%)。Q129/41 比值 > 0.4 的FFPE樣本所產出的文庫能夠達到最低測序質量要求。

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