重組桿狀病毒(rBV)是新型的體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)染載體，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已廣泛應(yīng)用于藥物篩選、腫瘤治療以及組織工程等領(lǐng)域。此外，rBV囊膜可用于蛋白質(zhì)/多肽展示，即其可作為疫苗遞送平臺。

　　優(yōu)化重組桿狀病毒，以作為哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染工具的主要驅(qū)動力，是相比現(xiàn)有的基因?qū)胼d體，其具有諸多優(yōu)勢，如對哺乳動物宿主無致病性、可容納更大量的外源基因插入以及可使用昆蟲細(xì)胞系穩(wěn)定生產(chǎn)高滴度的產(chǎn)物。

　　但是桿狀病毒與眾不同的特性，特別是表面異質(zhì)性和非球形的棒狀結(jié)構(gòu)，對于建立穩(wěn)定的下游工藝提出了較大的挑戰(zhàn)，特別是臨床級產(chǎn)品的制備。而且，為達(dá)到目的治療效果，體內(nèi)臨床應(yīng)用需要大量的病毒載體，并需有效去除污染物，后者可能會抑制轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、導(dǎo)致宿主免疫反應(yīng)、形成不必要的負(fù)作用。對效價和質(zhì)量的要求，使重組桿狀病毒的生產(chǎn)，需要使用高效、可放大的純化和濃縮方法。

　　往常，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液后，重組桿狀病毒的純化和濃縮需要一系列的離心/超速離心步驟。但是，超速離心方法相當(dāng)耗時耗力，且容易導(dǎo)致感染力顯著下降，原因可能是病毒顆粒形成了不可逆的聚集，所以使用這種方法時，通常會出現(xiàn)低回收率、低重復(fù)性的結(jié)果。也有實(shí)驗(yàn)使用體積排阻或陽離子交換層析進(jìn)行純化，或使用磁珠對生物素化的載體進(jìn)行濃縮，但在效率和可放大性上總有所欠缺。

　　進(jìn)入臨床應(yīng)用時，動物細(xì)胞培養(yǎng)來源的雜質(zhì)是主要問題之一，包括宿主細(xì)胞DNA、宿主細(xì)胞蛋白以及內(nèi)毒素。用于臨床實(shí)驗(yàn)的病毒載體，如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒，都需要多種下游純化步驟的結(jié)合，包括濃縮、捕獲及精制等，以將這些雜質(zhì)降低至可接受的水平。

　　本文介紹一種基于膜技術(shù)的簡單、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的重組桿狀病毒下游純化策略，包括澄清、濃縮/洗濾等，其可顯著降低工藝時間和驗(yàn)證成本，并便于向cGMP操作進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

　　實(shí)驗(yàn)

　　Sf-9昆蟲細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)，擴(kuò)增后轉(zhuǎn)移至25L波浪式生物反應(yīng)器。感染時活細(xì)胞濃度為1-2x10^6cells/mL，重組桿狀病毒感染復(fù)數(shù)約為每細(xì)胞0.1PFU。細(xì)胞活性至50%時，收獲病毒生產(chǎn)料液。

　　下游澄清使用0.65μm孔徑的mPES中空纖維切向流過濾膜，從含有重組桿狀病毒的上清液中去除較大的細(xì)胞顆粒及聚集物。然后再使用100kD中空纖維超濾膜濃縮至100ml后，再以D-PBS緩沖液進(jìn)行洗濾換液。兩步操作均使用KrosFlo切向流過濾系統(tǒng)，通過KF Comm數(shù)據(jù)采集軟件記錄進(jìn)樣、回流及濾液壓力等完整操作參數(shù)，同時在兩步操作中，通過自動背壓閥，分別控制濾液或跨膜壓力恒定，并根據(jù)實(shí)時剪切計(jì)算，調(diào)整循環(huán)流速，以維持病毒完整性及活性。

　　之后以陰離子交換膜層析進(jìn)行病毒捕獲，再脫鹽、除菌過濾后獲得所需終產(chǎn)物。

　　實(shí)驗(yàn)使用RT-qPCR以及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測總病毒及感染性病毒滴度，并以HepG細(xì)胞系用作靶細(xì)胞系，檢測病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。此外，每步純化步驟后，使用SDS-Page和WB檢測樣品中蛋白含量。內(nèi)毒素水平使用LAL法測試，并用電鏡分析rBVs完整性及形態(tài)，動態(tài)光散射法檢測樣品顆粒的水動力學(xué)粒徑。

　　結(jié)果

　　使用中空纖維切向流微濾進(jìn)行澄清可替換離心，且結(jié)合使用可拋棄型封閉流路，可維持料液的無菌狀態(tài)，防止污染。由于桿狀病毒顆粒較大(60 x 300nm)，選擇較大的孔徑可降低過濾器內(nèi)可能的病毒聚集和截留。 該步感染性病毒顆粒回收率可達(dá)>95%。

　　對于病毒產(chǎn)品的大規(guī)模純化和濃縮，切向流過濾是最常用的技術(shù)，其可同時降低低分子量雜質(zhì)的含量。 操作時，最佳循環(huán)流速和跨膜壓等操作條件都需通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，以降低膜污染及由其導(dǎo)致的產(chǎn)物損失。在桿狀病毒處理中，通常需控制TMP<10psi，避免膜表面凝膠層的快速形成。在優(yōu)化的條件下，病毒回收率可達(dá)>75%，濃縮因子可達(dá)10倍以上。此外，雖然有報(bào)道顯示重組桿狀病毒對剪切應(yīng)激的耐受性較好，但其仍是需要控制的主要條件之一。

　　在澄清及純化濃縮之后，為達(dá)到體內(nèi)/外臨床測試的質(zhì)量要求，產(chǎn)品需進(jìn)一步處理，根據(jù)病毒特性，可使用離子交換工藝。

　　多個批次間的重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定了該方法的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，工藝總回收率及終產(chǎn)物純度與使用傳統(tǒng)方法相當(dāng)或更優(yōu)，而切向流過濾的其它優(yōu)勢，還在于更短的時間內(nèi)處理更大量的料液及可拋棄型使用，有利于cGMP操作。

　　KrosFlo Research 2i (KR2i)切向流過濾系統(tǒng)

　　仕必純KrosFlo Research 2i (KR2i)切向流過濾系統(tǒng)是仕必純新近推出的新一代全整合式切向流過濾系統(tǒng)，系統(tǒng)采用高精度蠕動泵，并整合了數(shù)據(jù)采集軟件，可實(shí)時監(jiān)測完整工藝參數(shù)，方便記錄、分析和優(yōu)化，保證工藝可重復(fù)性，并便于工藝放大。

　　系統(tǒng)流路采用標(biāo)準(zhǔn)接頭設(shè)計(jì)，可兼容不同構(gòu)型的超濾、微濾單元，即可在一個系統(tǒng)上，完成多個步驟的操作。如采用仕必純定制式、可拋棄型流路，更可保證工藝無菌性，避免污染，簡化操作。