微生物的前沿研究主要依托于核酸測序速度和通量的增加。在1977-2005年間，主要的測序方法為Sanger雙脫氧鏈終止法，但是如果利用它進行單個細菌基因組測序可能需要花費多年的時間，因此隨著高通量測序技術的推出，Sanger法很快就退出了主流舞臺。

高通量測序技術使用了多個高通量測序平臺：第一種是Roche GS20 454（羅氏的454平臺，2005-2016），該平臺主要基于焦磷酸測序原理。雖然454測序是一個關鍵的技術進步，但是該平臺存在測序試劑昂貴、復雜重復序列錯誤率高以及磁珠載荷存在局限等缺陷，從而限制了其通量和獲得的序列條數。第二種是Solexa（現在的Illumina）Genome Analyzer (GA)，該平臺借助于邊合成邊測序、可逆阻斷和橋式PCR等技術，被廣泛應用于人、微生物等領域的核酸測序研究，而且個別儀器單個run可產生>1.8 TB的數據。Illumina目前包括GA, MiSeq 和HiSeq系列等多個測序平臺，可以進行100-300 bp 雙端測序，有望實現每年進行大于18000個人的基因組測序（3 Gbp，每個人1000美元）。此外，Illumina還推出了TruSeq（Moleculo）平臺，讀長可達到>8 kbp ，該平臺推進了高復雜微生物群落中微生物序列的組裝。

圖1. 不同測序技術的通量和讀長。

單分子測序技術是微生物組研究中新興的測序技術。該技術中，首屈一指的當屬PacBio的SMRT測序技術，該技術基于依靠拴系的DNA聚合酶和零模式波導來引導光能通過小體積的液體。PacBio提供的reads長度可以達到10-25 kbp，每個cell可以提供 ~300 Mbp數據。此外，該技術還可以檢測特殊的或者修飾后的核酸堿基（不需要在合成過程中進行化學修飾），這是因為遇到特殊的堿基之后聚合酶會發生wobble。

另一種單分子測序平臺為Oxford Nanopore，該平臺主要依賴于被測核酸序列通過蛋白納米孔時電導率的變化，通過監測電導率的變化進行測序，該平臺同樣可以檢測被修飾的堿基，平均讀長~1-2 kbp，有研究表明最長讀長甚至達到>90 kbp，該平臺最大的優點是可以利用無線技術傳輸數據并進行實時分析。

這些新興技術的主要挑戰是獲得數百條長度為kbp甚至Mbp的高質量和大分子量的DNA，例如，PacBio測序平臺需要微克級高分子量DNA（>40 kbp）用于文庫構建。此外，這些技術的通量都相對比較低。但是對于序列組裝方面的應用而言，這些單分子測序平臺為微生物群落研究提供了一定的技術支撐。

DNA測序技術在發現、識別、鑒定微生物潛在功能方面發揮著重要作用，目前大部分的研究主要是多樣性研究，即利用微生物基因組片段上一段擴增子序列進行細菌、真菌以及古菌的測序分析。此外，也有部分宏基因組方面的研究，利用該研究可以發現微生物群落中與某一特殊物種相關的功能基因。然而，大部分基因的功能目前還是未知的，這預示著對于環境微生物的研究依然任重而道遠。

宏轉錄組技術是對某環境中所有微生物的mRNA進行測序分析，從而來探索某一時間或空間中特定微生物的基因表達情況。該技術有助于對宏基因組數據進行相關驗證以及了解不同環境中微生物相對活性的變化情況。

2. 基于質譜技術的宏蛋白組學和宏代謝組學研究

盡管測序技術很大程度上加強了人們對于微生物系統發育以及功能基因組成的認識與理解，但是要想研究執行生命功能的蛋白質以及與其相關的代謝產物與環境等因素之間的關系，僅僅依靠這些數據還遠遠不夠，因此需要借助質譜技術達到這一研究目的。在利用質譜技術進行微生物群落樣本分析時，感興趣的生物分子會被離子化，并根據質荷比分離開來，以達到檢測的目的。質譜分析具有高靈敏度、高分辨率和高通量的特點。

自1984年electrospray ionization (ESI，電噴霧離子化技術)產生以來，利用質譜技術進行生物分子的研究日益劇增。電噴霧離子化技術的局限是需要在760 torr的氣壓下進行，但是質譜分析的氣壓要求在10^-6 and 10^-11 torr之間，兩者間的氣壓差至少有9個數量級，如果離子化程序和質譜分析程序未能完美的契合，會導致大量離子流失。因此，在過去的20年，質譜研究主要聚焦在優化ion funnels和transmission quadrupole部分的接口設計，旨在解決銜接過程中減壓問題，該部分的優化有利于降低離子流失并提高分析的敏感性。

然而，因為質譜結果的高動態范圍以及樣本中組成種類成千上萬，所以利用質譜技術研究微生物群落生物分子存在一定的難點。為克服這一難點，要求質譜技術要有高分辨率、高準確性和高速度等特性。

在orbitrap（軌道阱）技術出現之前，Quadrupole（ 四極桿質量分析質譜）, ion trap（離子阱質譜）, time-of-flight（飛行時間質譜）和ion cyclotron resonance (ICR，離子迥旋共振分析質譜）是主要的幾種質譜技術。在過去的幾十年中，orbitrap技術發展出了包括 linear ion trap (low resolution) 和orbitrap（high resolution）在內的具有高分辨率和高掃描率的技術。

圖2. 基于離子阱的質譜技術演變。

此外，分離技術的發展，例如一維和二維的液相色譜分離技術、氣相離子遷移譜法都促進了微生物群落的研究。這些分離技術降低了樣本檢測前的復雜度，提高了檢測樣品中蛋白質和代謝物的覆蓋率。

3.復雜環境微生物研究的局限和未來的方向

在過去幾十年中，核酸測序技術以及質譜技術的發展使得研究復雜環境微生物群落結構成為可能。早在2000年，Banfield和其課題組成員首次結合高通量測序技術與質譜技術研究了酸性廢礦水中多樣性較低的微生物群落結構。隨后，利用高通量測序技術、質譜技術或者兩種技術結合進行微生物群落的研究日漸增長。隨著技術的不斷提高，人們期望對于微生物群落表型的認識能夠更加深入。

圖3. 微生物群落研究歷程。

目前，對于微生物群落功能的認識與理解仍然是任重道遠。當然，在該過程中依舊面臨著很多挑戰。其中最大的難題是生物信息學和計算方面瓶頸，包括非冗余基因集構建、微生物注釋信息的完善和多組學結合的算法問題。面臨的挑戰還包括生物大分子的抽提；完整基因組數據的組裝；利用質譜技術研究宏蛋白組、宏代謝組數據需要更快速、通量更高等。

其實，除了挑戰，微生物群落研究的前景還是很寬廣的。近來，白宮科學和技術政策辦公室（OSTP）宣布啟動新的國家微生物組計劃（National Microbiome Initiative ，NMI），該計劃旨在提高微生物研究的相關技術，推進對微生物群落的理解。人們堅信這項政策會更快的推進核酸測序技術以及質譜技術在微生物研究領域的應用，并獲得更加深入的微生物群落的相關信息。此外，人們還期望，在這項政策的鼓舞下會誕生前所未有的新技術，例如，更高分辨率的肽段（或者代謝物）離子遷移分離手段或者新的可用于分子注釋的數據庫。

這些技術和計算的改進為破譯微生物在其所處環境中扮演的角色以及其對其他生物，甚至對生態系統的健康與可持續性的影響在未來十年將發揮至關重要的作用。

如此深入了解微生物群落的表型將有助于更好地理解一些過程，例如氣候變化、疾病對微生物功能的影響，使得我們能夠更好的預知這些變化可能造成的影響，促進生態系統可持續發展和人類健康的策略。