概念：概括地說，轉(zhuǎn)染是使用非病毒感染的手段人工引入核酸（DNA或RNA）進入細胞的過程。轉(zhuǎn)染的目的是產(chǎn)生重組蛋白，或特異性增強或抑制轉(zhuǎn)染細胞中的基因表達。
轉(zhuǎn)染的類型
根據(jù)導(dǎo)入的核酸存在于宿主細胞的時間長短，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學(xué)，生物，物理方法。
瞬轉(zhuǎn)：因為導(dǎo)入的核酸沒有整合到宿主細胞基因組，因此它只會短暫地存在于宿主細胞中，不會隨著細胞的分裂而進入到子代細胞中。然而，導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)的高拷貝數(shù)導(dǎo)致其在細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表達水平較高。根據(jù)所使用的載體的不同，瞬轉(zhuǎn)通常可以1至7天內(nèi)進行基因檢測，但是瞬時轉(zhuǎn)染的細胞通常在轉(zhuǎn)染后24-96小時收獲。當(dāng)使用超螺旋質(zhì)粒DNA時，瞬時轉(zhuǎn)染的效果最好，推測是由于超螺旋質(zhì)粒DNA能更有效地被細胞攝取。
穩(wěn)轉(zhuǎn)：外源DNA整合到細胞基因組中或作為附加體質(zhì)粒保留在細胞中。與瞬時轉(zhuǎn)染不同，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染允許外源DNA在轉(zhuǎn)染的細胞及其后代中的長期維持。然而，通常是將單拷貝或幾個拷貝的外源DNA整合到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞的基因組中，因此，其表達水平一般低于瞬時轉(zhuǎn)染的表達水平。
由于穩(wěn)轉(zhuǎn)效率較低，因此選用有效地轉(zhuǎn)染策略和篩選方法很重要。其中比較可靠地篩選方法是在DNA載體中包含選擇性標(biāo)記，然后在細胞轉(zhuǎn)染短暫性恢復(fù)后進行適當(dāng)?shù)剡x擇性加壓。盡管相對于超螺旋DNA，線性DNA被細胞攝取的效率較低，但其能最有效地整合到宿主基因組中。
目前，由于各種轉(zhuǎn)染試劑的發(fā)明，哺乳動物細胞的瞬時轉(zhuǎn)染已經(jīng)用于生產(chǎn)具有適當(dāng)折疊和翻譯后修飾的重組蛋白。但表達mg/L-g/L的重組蛋白主要依賴于穩(wěn)定細胞系的產(chǎn)生。
瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)的比較
| 瞬轉(zhuǎn) | 穩(wěn)轉(zhuǎn) |
導(dǎo)入的DNA沒有整合到基因組中，而是保留在細胞核上 | 導(dǎo)入的DNA整合到基因組中 |
導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)不傳遞到子代； 遺傳改變只是暫時的 | 導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)能夠代代相傳；遺傳改變是永久的 |
不需要選擇性篩選 | 需要選擇性篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞 |
DNA載體和RNA都可用于瞬時轉(zhuǎn)染 | 只有DNA載體可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；RNA本身不能穩(wěn)定地導(dǎo)入細胞中 |
導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)的高拷貝數(shù)導(dǎo)致高水平的蛋白質(zhì)表達。 | 單拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的穩(wěn)定整合的DNA導(dǎo)致較低水平的蛋白質(zhì)表達。 |
通常在轉(zhuǎn)染后24-96小時內(nèi)收獲細胞。 | 需要2-3周的時間篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆。 |
通常不適合使用具有誘導(dǎo)型啟動子的載體的研究。 | 適用于使用帶有誘導(dǎo)型啟動子的載體的研究。 |
轉(zhuǎn)染方式
細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，這對大分子物質(zhì)來說是個不可透過的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，其也帶負電荷。為了使核酸穿過細胞膜，研究人員開發(fā)了多種技術(shù)，大致分為三類：化學(xué)方法---利用載體分子包被核酸使其呈現(xiàn)中性電荷或正電荷。生物方法---利用基因工程病毒轉(zhuǎn)染非病毒基因到細胞中。物理方法---在細胞膜表面產(chǎn)生一個瞬時的孔從而導(dǎo)入DNA。然而，沒有一種方法適用于所有的細胞和實驗，理想的方法應(yīng)根據(jù)您的細胞類型和實驗需要進行選擇，理想的方法應(yīng)具有高轉(zhuǎn)染效率，低細胞毒性和對正常生理學(xué)的影響最小，并且易于使用和可重復(fù)性等特點。
化學(xué)轉(zhuǎn)染方法 | ||
技術(shù) | 優(yōu)點 | 缺點 |
陽離子脂質(zhì)體 |
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磷酸鈣共沉淀 |
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葡聚糖 |
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其他陽離子聚合物 |
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生物轉(zhuǎn)染方法 | ||
病毒轉(zhuǎn)染 |
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物理轉(zhuǎn)染方法 | ||
電轉(zhuǎn) |
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生物傳遞粒子傳遞（粒子轟擊） |
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顯微注射 |
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激光介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染（光轉(zhuǎn)染） |
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陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染
原理：陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染是目前最常用的轉(zhuǎn)染方式之一。陽離子脂質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)由帶正電荷的頭基和一個或兩個烴鏈組成，帶正電荷的頭基與帶負電荷的核酸通過靜電作用形成復(fù)合物，經(jīng)細胞的內(nèi)吞作用進入細胞。LifeTechnologies?提供了廣泛的陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染試劑，用于有效地將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸引入廣泛的細胞類型，包括Lipofectamine?3000試劑。當(dāng)選擇轉(zhuǎn)染試劑時，您必須考慮您希望導(dǎo)入（DNA，RNA或蛋白質(zhì)）的有效載荷以及要轉(zhuǎn)染的細胞類型，因為轉(zhuǎn)染試劑的選擇強烈影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。
實驗步驟：將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細胞中，脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復(fù)合物粘附到細胞膜上→復(fù)合物經(jīng)細胞內(nèi)吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。
磷酸鈣共沉淀
原理：將DNA與氯化鈣在磷酸緩沖鹽水中混合形成磷酸鈣-DNA沉淀物，然后將其分散在培養(yǎng)的細胞上，磷酸鈣促進共沉淀物中的縮合DNA與細胞表面的結(jié)合，DNA通過內(nèi)吞作用進入細胞。
實驗步驟：將氯化鈣和DNA混合，以可控的方式加入磷酸緩沖液。→在室溫下孵育，以形成極細，可溶的共沉淀微粒→將磷酸鈣-DNA沉淀物加入細胞中，后者能黏附到細胞膜表面→共沉淀物經(jīng)細胞內(nèi)吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。
病毒轉(zhuǎn)染
原理：對于用脂質(zhì)體不能實現(xiàn)轉(zhuǎn)染的細胞，可以采用病毒轉(zhuǎn)染。腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動物細胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染。
實驗步驟：通過基因克隆方法獲得重組病毒表達載體→轉(zhuǎn)染包裝細胞系，擴增并分離得到重組病毒顆粒→純化并滴定病毒液→轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細胞（含有病毒特異性的受體）→從培養(yǎng)基中移除病毒→檢測基因表達或沉默情況。
電轉(zhuǎn)
原理：利用電脈沖在細胞膜上形成暫時的孔使核酸物質(zhì)能穿過孔進入細胞。
實驗步驟：利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細胞→對含有核酸，緩沖液，細胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細胞膜上形成電勢差，誘導(dǎo)產(chǎn)生暫時的孔使核酸進入細胞→將細胞返回到生長培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復(fù)→檢測基因表達或沉默情況。
